推荐一种用于溶酶体标记的荧光染料及其合成方法和应用与流程

将乐信息网 http://www.jianglexinxi.cn 2020-10-18 15:34 出处:网络
如下提供的推荐一种用于溶酶体标记的荧光染料及其合成方法和应用与流程,接下来的内容为您介绍:

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本发明属于荧光染料技术领域,具体涉及一种用于溶酶体标记的荧光染料及其合成方法和应用。



背景技术:

溶酶体是真核细胞中的一种细胞器,呈单层膜包被的囊状结构,大小直径约0.025-0.8μm,在物质代谢、细胞膜循环、细胞凋亡等细胞的各种生命活动中都发挥着十分重要的作用。因此,溶酶体的可视化在活性物种的检测和关键生理过程的监测等方面扮演着非常重要的角色,不仅有助于理解溶酶体参与生命活动的分子机制,而且对疾病的发生发展的基础研究有着十分重要的意义。

而随着激光共聚焦与高分辨技术的迅速发展,荧光成像技术的运用已为溶酶体的可视化提供了一种更好的途径。目前,应用于溶酶体成像与检测的荧光染料已成为荧光显微成像领域的研究热点。但市面上大多数的溶酶体荧光染料,在生物成像中存在许多缺陷,例如,结构稳定性及光稳定性较差、光致毒性大等,在很大程度上限制了其在溶酶体成像中的应用。目前超分辨技术对染料的荧光稳定性及强度等方面有着十分高的要求,亟待高稳定性、高亮度的荧光染料的出现,所以开发用于溶酶体标记的高亮度高稳定性的荧光染料具有十分广阔的应用前景。



技术实现要素:

本发明的目的是提供一种用于溶酶体标记的荧光染料及其合成方法和应用,该染料在合成过程中所涉及到的方法具有原料廉价易得,合成操作简单,提纯方法便于操作等特点。此外,该染料能够在较低的浓度(500nm)条件下,在活细胞内对溶酶体进行特异性标记。

本发明提供一种用于溶酶体标记的荧光染料,以萘酰亚胺为荧光团,在其n位引入一个n-(2-胺乙基)吗啉取代基,在4,5-位引入两个氮杂环丁烷取代基,设计合成了荧光染料—lyso-daze。该荧光染料对多种细胞进行染色后能特定的标记细胞内的溶酶体,具有荧光强度高且稳定、染色浓度低且染色速度快、生物相容性好等特点。

一种用于溶酶体标记的荧光染料,该荧光染料具有如下结构:

一种用于溶酶体标记的荧光染料的合成方法,其合成路线,如下:

具体合成步骤如下:

(1)中间体lyso-nbr的合成:

将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙醇中,并向其中滴加n-(2-胺乙基)吗啉;将反应液加热至70-140℃,反应3-10h后,减压蒸馏除去溶剂,残余物经200-300目二氧化硅硅胶柱分离,以体积比为200-50:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂,除去溶剂,得到黄色固体中间产物lyso-nbr;

(2)探针lyso-daze的合成:

将中间体lyso-nbr溶于乙二醇甲醚中,并向其中加入氮杂环丁烷。将反应液缓慢加热至120-160℃,并反应15-30h。减压除去乙二醇甲醚,残余物经200-300目二氧化硅硅胶柱分离,以体积比为50-5:1为二氯甲烷和甲醇为洗脱剂,除去溶剂,得黄色固体探针lyso-daze。

步骤(1)中,4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺:n-(2-胺乙基)吗啉的质量比为5:3-12;4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙醇的体积比为1:40-120g/ml。

步骤(2)中,中间体lyso-nbr:氮杂环丁烷的质量比为1:1-4;中间体lyso-nbr的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:100-400g/ml。

一种用于溶酶体标记的荧光染料在活细胞内对溶酶体的荧光成像领域的应用。

一种用于溶酶体标记的荧光染料在活细胞内能够对溶酶体进行特异性标记并实现实时荧光成像。

本发明中的染料在合成方面具有原料廉价易得,合成方法简单且提纯手段易于操作等优点。该染料在水中荧光发射波长能够达到498nm左右,且具有非常高的荧光稳定性,为其能够作为一种用于溶酶体标记的高亮度高稳定性的荧光染料奠定了坚实的基础。

该染料能够作为荧光探针用于活细胞中对溶酶体的特异性标记及超分辨荧光成像。

附图说明

图1为实施例1制备的lyso-nbr的核磁共振氢谱。

图2为实施例1制备的lyso-daze的核磁共振氢谱。

图3为实施例1制备的lyso-daze的核磁共振碳谱。

图4为实施例1制备的lyso-daze的高分辨质谱。

图5为实施例1制备的溶酶体染料lyso-daze在水中的激发与荧光发射谱图,横坐标为波长,纵坐标为归一化荧光强度,荧光探针的浓度为10μm。

图6为实施例1制备的溶酶体染料lyso-daze的骨髓干细胞的荧光成像图。

具体实施方式

实施例1

溶酶体染料lyso-daze的合成方法。

中间体lyso-nbr的合成:

4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.50g,1.56mmol)溶于40ml乙醇中,并向其中滴加n-(2-胺乙基)吗啉(0.609g,4.68mmol)。70℃下反应3h后,减压蒸馏除去溶剂,残余物经硅胶柱(二氯甲烷:甲醇=200-50:1,v/v)分离得土黄色固体1.12g,产率55%。其核磁谱图氢谱如图1所示,具体数据如下:

1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.71(d,j=7.8hz,1h),8.52(d,j=7.9hz,1h),8.22(d,j=7.9hz,1h),7.93(d,j=7.8hz,1h),4.33(t,j=6.6hz,2h),3.71–3.57(m,4h),2.70(t,j=6.5hz,2h),2.57(s,4h).

染料lyso-daze的合成:

将中间体lyso-nbr(50mg,0.12mmol)溶于10ml乙二醇甲醚中,向其中加入氮杂环丁烷100mg。将反应液缓慢加热至120℃,并反应15h。减压除去乙二醇甲醚,残余物经硅胶柱分离(二氯甲烷:甲醇=50:1,v/v),得黄色固体6mg,产率12%。其核磁谱图氢谱和碳谱如图2、3所示,具体数据如下:

1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.37(d,j=8.5hz,2h),6.39(d,j=8.5hz,2h),4.37–4.30(m,2h),4.07(s,8h),3.75–3.66(m,4h),2.72–2.66(m,2h),2.62(s,h),2.43(s,4h).

13cnmr(101mhz,cdcl3)δ164.37,155.62,133.17,132.88,110.06,107.98,106.34,67.13,56.42,54.62,53.80,36.67,16.90.

lyso-daze的高分辨质谱如图4所示,具体数据如下:

c24h29n4o3[m+h]+理论值:421.2234,实际值:421.2203。

经检测,其结构如上式lyso-daze所示,其荧光性能如下:

将该染料lyso-daze溶解于dmso溶液中,配制成浓度为2mm的母液,取20μllyso-daze母液,加入4ml水中,配制成10μm的荧光染料测试液,并进行荧光光谱的测试。lyso-daze在水中的归一化的荧光激发与发射谱图如图5所示:

在水中的荧光激发波长为481nm,荧光发射波长为498nm,且具有非常优异的荧光稳定性。

实施例2

溶酶体染料lyso-daze的合成方法。

中间体lyso-nbr的合成:

4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.75g,2.34mmol)溶于30ml乙醇中,并向其中滴加n-(2-胺乙基)吗啉(0.45g,3.46mmol)。140℃下反应10h后,减压蒸馏除去溶剂,残余物经硅胶柱(二氯甲烷:甲醇=200-50:1,v/v)分离得土黄色固体0.47g,产率46%。

染料lyso-daze的合成:

将中间体lyso-nbr(75mg,0.18mmol)溶于75ml乙二醇甲醚中,向其中加入氮杂环丁烷(75mg,1.31mmol)。将反应液缓慢加热至160℃,并反应30h。减压除去乙二醇甲醚,残余物经硅胶柱分离(二氯甲烷:甲醇=50:1,v/v),得黄色固体7mg,产率10%。

经检测,其结构如上式lyso-daze所示。其荧光性能如下:

荧光染料lyso-daze的浓度为10μm,在水中的荧光激发波长为481nm,荧光发射波长为498nm,且具有非常优异的荧光稳定性。

实施例3

溶酶体染料lyso-daze的合成方法。

中间体lyso-nbr的合成:

4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(0.9g,2.81mmol)溶于108ml乙醇中,并向其中滴加n-(2-胺乙基)吗啉(2.16g,16.60mmol)。120℃下反应8h后,减压蒸馏除去溶剂,残余物经硅胶柱(二氯甲烷:甲醇=200-50:1,v/v)分离得土黄色固体0.51g,产率42%。

染料lyso-daze的合成:

将中间体lyso-nbr(100mg,0.24mmol)溶于40ml乙二醇甲醚中,向其中加入氮杂环丁烷(400mg,7mmol)。将反应液缓慢加热至140℃,并反应24h。减压除去乙二醇甲醚,残余物经硅胶柱分离(二氯甲烷:甲醇=50:1,v/v),得黄色固体8mg,产率8%。

经检测,其结构如上式lyso-daze所示,其荧光性能如下:

荧光染料lyso-daze的浓度为10μm,在水中的荧光激发波长为481nm,荧光发射波长为498nm,且具有非常优异的荧光稳定性。

实施例4

lyso-daze对活细胞染色后荧光成像图。取0.5μllyso-daze母液溶于1ml细胞培养液中,37℃,5%co2下孵育10分钟后分别进行荧光共聚焦成像。

lyso-daze对活细胞染色后荧光成像图如图6所示:

lyso-daze终浓度为500nm的细胞培养液孵育骨髓干细胞10分钟后的共聚焦荧光成像,骨髓干细胞内的溶酶体清晰可见,实现了lyso-daze对活细胞内的溶酶体进行特异性荧光标记。


技术特征:

1.一种用于溶酶体标记的荧光染料,其特征在于该荧光染料的结构如下:

2.一种如权利要求1所述的用于溶酶体标记的荧光染料的合成方法,其特征在于该方法包含合成步骤如下:

(1)中间体lyso-nbr的合成:

将4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺溶于乙醇中,并向其中滴加n-(2-胺乙基)吗啉;将反应液加热至70-140℃,反应3-10h后,减压蒸馏除去溶剂,残余物经200-300目二氧化硅硅胶柱分离,以体积比为200-50:1的二氯甲烷和甲醇为洗脱剂,除去溶剂,得到黄色固体中间产物lyso-nbr;

(2)探针lyso-daze的合成:

将中间体lyso-nbr溶于乙二醇甲醚中,并向其中加入氮杂环丁烷。将反应液缓慢加热至120-160℃,并反应15-30h;减压除去乙二醇甲醚,残余物经200-300目二氧化硅硅胶柱分离,以体积比为50-5:1为二氯甲烷和甲醇为洗脱剂,除去溶剂,得黄色固体探针lyso-daze。

3.根据权利要求1所述的用于溶酶体标记的荧光染料的合成方法,其特征在于步骤(1)中,4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺:n-(2-胺乙基)吗啉的质量比为5:3-12;

4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺的质量与乙醇的体积比为1:40-120g/ml。

4.根据权利要求1所述的用于溶酶体标记的荧光染料的合成方法,其特征在于步骤(2)中,中间体lyso-nbr:氮杂环丁烷的质量比为1:1-4;

中间体lyso-nbr的质量与乙二醇甲醚的体积比为1:100-400g/ml。

5.一种如权利1所述的用于溶酶体标记的荧光染料在活细胞内对溶酶体的荧光成像领域的应用。

技术总结
本发明提供了一种用于溶酶体标记的荧光染料及其合成方法和应用,该荧光染料以萘酰亚胺为荧光团,在其N位引入一个N‑(2‑胺乙基)吗啉取代基,在4,5‑位引入两个氮杂环丁烷取代基,设计合成了一种新型溶酶体荧光染料—Lyso‑DAze,其结构式如(1)所示,该染料的荧光发射波长为498nm,且具有十分优异的荧光稳定性及高荧光强度,能够在较低的浓度(500nM)条件下,实现活细胞内的溶酶体的特异性标记。所述Lyso‑DAze染料满足目前超分辨技术对荧光染料的高稳定性、高亮度的要求,使得溶酶体可视化在对疾病的发生发展的基础研究方面有着十分广阔的应用前景。

技术研发人员:徐兆超;许宁;乔庆龙
受保护的技术使用者:中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日:2018.12.18
技术公布日:2020.06.26

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