最新可裂解连接单元及其合成方法与用途的制作方法

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专利名称:可裂解连接单元及其合成方法与用途的制作方法
技术领域
本发明涉及用于DNA合成测序的化合物的化学合成领域,尤其涉及一类新型可裂解连接单元及其合成方法与用途。
技术背景DNA测序技术是现代生物学研究中重要的手段之一。人类基因组计划完成后,DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNA sequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列,也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医药科学等具有非常重要的意义。
合成法测序Sequencing By Synthesis, SBS)是新一代DNA测序技术之一。合成法测序方法通过把大量被测的模板DNA片段进行固定,并在固定化的DNA测序模板上杂交结合通用的DNA引物,分别控制四种核苷酸在DNA引物上的延伸。通过检测延伸反应过程或延伸核苷酸,实现高通量并行的DNA序列信息的检测。
在合成法测序中,首先要合成DNA链延长的四种核苷酸原料,又叫“可逆终端” (reversible terminator).这类核苷酸除了要求-羟基阻断外,为了不影响下一个指示核苷酸的并入和识别,还要求通过一个可裂解的连接单元把核苷酸和指示分子,例如荧光素,连接起来。然后,在下一个指示核苷酸并入之前,在温和条件下使这个连接单元断裂, 继续DNA链的延长,从而读出DNA碱基的序列。该连接单元对合成法测序的读长和效率有重要影响,因此,人们也一直致力于发展新的可裂解连接单元,来提高DNA测序的效率。目前已报道的连接单元有二硫键、光裂解、Pd催化裂解、氟化物可裂解等。
Robi D. Mitra Jay, Shendure Jerzy Olejnik, Edyta~Krζymanska-01ejnik and George Μ. Churcha. Fluorescent in situ sequencing on polymerase colonies. Analytical Biochemistry 320 (2003) 55 - 65.该文献中报道了一种二硫键连接单元, 通过该连接单元把荧光素和脱氧核苷酸连接起来,该核苷酸在聚合酶作用下并入并被检测后,在2-巯基乙醇的作用下使二硫键断裂,实现测序的循环。Gerardo Turcatti, Anthony Romieuj Milan Fedurco and Ana-Paula Tairi. A new class of cleavable fluorescent nucleotides: synthesis and optimization as reversible terminators for DNA sequencing by synthesis. Nucleic Acids Research, 2008, Vol. 36, No. 4 .该文献中报道以二硫键作为可裂解连接单元,合成了一类新的荧光标记核苷酸作为可逆终端,用于DNA合成测序,但是,只能测定10个核苷酸序列,读长太短。但是Pleasants, J. C·; Guo, W. ; Rabenstein, D. L. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6553—6558 禾口 Huyghues-Despointes, B. Μ. P. ; Nelson, J. W. Biochemistry 1992, 311476-1483 M 篇文献中报道在某些条件下,二硫键不稳定,并且二硫键的形成和断裂是一个可逆的过程。
Jingyue Ju 课题组在文献 Zengmin Li,Xiaopeng Baij Hameer Ruparelj Sobin Kimj Nicholas J. Turroj and Jingyue Ju. A photocleavable fluorescent nucleotide for DNA sequencing and analysis. PNAS January 21, 2003 ,vol. 100 ,no. 2,414-419. Tae Seok Seoj Xiaopeng Baij Hameer Ruparelj Zengmin Li,Nicholas J. Turroj and Jingyue Ju. Photocleavable fluorescent nucleotides for DNA sequencing on a chip constructed by site-specific coupling chemistry. PNAS April 13,2004, vol. 101,no. 15,5488—54936. Tae Seok Seoj Xiaopeng Baij Dae Hyun Kimj Qinglin Mengj Shundi Shij Hameer Ruparelj Zengmin Li,Nicholas J. Turroj and Jingyue Ju. Four-color DNA sequencing by synthesis on a chip using photocleavable fluorescent nucleotides. PNAS April 26, 2005, Vol. 102, No. 17,5932-5937. Qinglin Mengj Dae Hyun Kim,Xiaopeng Bai,Lanrong Bi,Nicholas J. Turroj and Jingyue Ju. Design and Synthesis of a Photocleavable Fluorescent Nucleotide 3' -0-Allyl-dGTP-PC-Bodipy-FL-510 as a Reversible Terminator for DNA Sequencing by Synthesis. J. Org. Chem. 2006,71,3248-3252 中报道了一种光可裂解连接单元,并将其作为可逆终端应用于合成测序中,但是该连接单元应用于测序时读长太短,这影响了合成测序的效率。
Jingyue Ju课题组在文献Lanrong Bi,Dae Hyun Kimj and Jingyue Ju. Design and Synthesis of a Chemically Cleavable Fluorescent Nucleotide,3' -O-Allyl-dGTP-allyl-Bodipy-FL-510, as a Reversible Terminator for DNA Sequencing by Synthesis. J. AM. CHEM. SOC. 2006,128,2542 -2543. Jingyue Juj Dae Hyun Kimj Lanrong Bi, Qinglin Mengj Xiaopeng Baij Zengmin Li, Xiaoxu Li,Mong Sano Marmaj Shundi Shi,Jian Wuj John R. Edwards, Aireen Romuj and Nicholas J. Turro. Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators. PNAS December 26, 2006, vol. 103 No. 52,19635—19640 和美国专利Intent No. US7883869 B2 (2011)中报道了两种Pd催化可裂解连接单元,该连接单元根据3 ζ -羟基烯丙基阻断衍生而来,但是应用于测序时,裂解条件不够温和,有时会破坏其它结构,同时读长不够长,影响合成测序的通量。
Diana C. Knappj Jennifer D'Onofrio, and Joachim W. EngeIs. Fluorescent Labeling of (Oligo)Nucleotides by a New Fluoride Cleavable Linker Capable of Versatile Attachment Modes. Bioconjugate Chem. 2010, 21, 1043 - 1055. 中报道了一种氟化物可裂解的连接单元。Dirna C. Knappj Saulius Servaj Jennifer D'Onofrio, Angelika Keller, Arvydas Lubysj Ants Kurgj Maido Remmj and Joachim W. Engels. Fluoride-Cleavablej Fluorescently Labelled Reversible Terminators: Synthesis and Use in Primer Extension. Chem. Eur. J. 2011,17,2903 - 2915.该文献中进一步报到了利用这种氟化物可裂解的连接单元合成了四种荧光标记的核苷酸,作为合成测序中的可逆终端。但是在测序中,该连接单元的裂解需要的时间较长,这影响了测序的效率。
可裂解连接单元对合成法测序的读长和效率有重要的影响,而现有的连接单元存在裂解条件不够温和、裂解效率不高,用于测序时读长太短等缺点,因此,设计、合成新的可裂解连接单元,并探索合适的裂解条件对于提高测序的效率、发展新的测序方法有非常重要的意义。发明内容5
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足,提供一类新型可裂解连接单元及其合成方法与用途。本发明基于羟基保护的思想,首次设计并合成了一类新的可裂解连接单元,该类化合物合成原料简单易得,合成过程均为常规化学反应,易于实现大量合成。该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率的连接。通过研究该类化合物的裂解性能,发现该类化合物在温和的条件下可以实现高效率的完全裂解,可应用于DNA测序。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的 本发明涉及一种可裂解连接单元,其结构式为
权利要求
1.一种可裂解连接单元,其特征在于,其结构式为
2.一种根据权利要求1所述的可裂解连接单元在DNA合成测序中的用途,其特征在于, 所述可裂解连接单元连接核苷酸和荧光素,用于DNA合成测序。
3.一种根据权利要求1所述的可裂解连接单元的合成方法,其特征在于,当η = 1时,包括以下合成步骤a、T-I的合成以L-谷氨酸为原料,加入盐酸,在冰浴搅拌下滴加亚硝酸钠溶液,滴加完毕后,继续在冰浴下反应3 证,然后移至室温下过夜;反应结束后,减压蒸去水,加入乙酸乙酯溶解,过滤,滤液用无水硫酸钠干燥,过滤,旋干溶剂得T-I ;b、T-2的合成取T-1,以无水四氢呋喃做溶剂,氮气保护,在冰水浴下缓慢滴加硼烷/ 二甲硫醚溶液,滴加完毕后,继续在室温下反应4 证;反应结束后,加入甲醇淬灭反应,旋去溶剂,再加入甲醇,旋干得T-2 ;c、T-3的合成取T-2,以二氯甲烷做溶剂,加入咪唑,氮气保护下和二甲基叔丁基氯硅烷在室温下反应17 20h ;反应结束后,加入二氯甲烷稀释,分别用2mol/L盐酸、水和饱和碳酸氢钠洗涤反应液,无水硫酸钠干燥,旋干,柱层析得T-3纯品;d、T-4的合成以二氯甲烷做溶剂,T-3在氮气保护及冰盐浴下和二异丁基氢化铝反应,TLC跟踪至反应完全.反应结束后,加入0.2mol/L HCl淬灭反应,二氯甲烷萃取,有机相用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤,无水硫酸钠干燥,旋转蒸发除去溶剂得T-4 ;e、T-5的合成以二氯甲烷做溶剂,T-4在氮气保护和冰盐浴下,加入三乙胺,然后和甲磺酰氯反应30 50min,在40 50°C回流3 5h,反应结束后,二氯甲烷稀释,水洗,无水硫酸钠干燥,旋干,柱层析得T-5 ;f、T-6的合成以二氯甲烷做溶剂,T-5在对甲苯磺酸吡啶盐作用下和原料A在室温下反应,TLC跟踪至反应完全,反应结束后,旋干溶剂,加入水,用乙酸乙酯萃取,饱和食盐水洗涤有机相,无水硫酸钠干燥,过滤,旋干,柱层析得到T-6纯品;所述原料A的结构式为 Ol^H6r,其中,m为0 20中的任意一个整数,k为1 20中的任意一个整g、T-7的合成以四氢呋喃做溶剂,在四丁基氟化胺作用下,T-6在室温下脱羟基保护,TLC跟踪至反应完全,反应结束后,旋干溶剂,柱层析得到T-7 ;h、T-8的合成把T-7溶于过量的氨水,室温下反应,TLC跟踪至反应完全,反应结束后,加乙醇,减压旋去溶剂,得T-8,T-8即所述可裂解连接单元;当η = 2时,包括以下合成步骤a、X-l的合成以N,N-二甲基甲酰胺做溶剂,2-羟基-3,4-二氢吡喃在NaH的作用下,和氯化苄在室温下反应,TLC跟踪至反应完全,反应结束后,滴加水除去未反应的NaH,用乙酸乙酯萃取,有机相分别用水、饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,减压旋去溶剂,柱层析得 X-I ;b、X-2的合成以二氯甲烷做为溶剂,把原料A溶于二氯甲烷,在对甲苯磺酸吡啶盐作用下,和X-I在室温下反应,TLC跟踪至反应完全,反应结束后,减压旋去溶剂,之后加入水, 用乙酸乙酯萃取,有机相分别用水、饱和食盐水洗,无水硫酸钠干燥,减压旋去溶剂,柱层析得X-2 ;所述原料A的结构式为ΗΟ^ Ι^Β,其中,m为0 20中的任意一个整数,k为1 20中的任意一个整c、X-3的合成以乙酸乙酯做溶剂,把X-2溶于乙酸乙酯,加入Pd/C并通入氢气, 室温下反应,TLC跟踪至反应完全,反应结束后,过滤,减压旋去溶剂,得X-3 ;d、X-4的合成把X-3溶于过量的氨水,室温下反应,TLC跟踪至反应完全,反应结束后, 加乙醇,减压旋去溶剂,得X-4,X-4即所述可裂解连接单元。
4.根据权利要求3所述的可裂解连接单元的合成方法,其特征在于,当η= 1时,步骤 a中所述盐酸为6 mol/L,加入的所述L-谷氨酸、盐酸和亚硝酸钠的摩尔比为1 :2 2. 5 1. 5 2。
5.根据权利要求3所述的可裂解连接单元的合成方法,其特征在于,当η= 1时,步骤 b中加入的所述T-I和硼烷的摩尔比为1 :1. 1 1. 5。
6.根据权利要求3所述的可裂解连接单元的合成方法,其特征在于,当η= 1时,步骤 c中加入的所述Τ-2、咪唑和二甲基叔丁基氯硅烷的摩尔比为1 :1. 1 1. 5 1. 1 1. 5。
7.根据权利要求3所述的可裂解连接单元的合成方法,其特征在于,当η= 1时,步骤 d中加入的所述T-3和二异丁基氢化铝的摩尔比为1 :1. 2 1. 5。
8.根据权利要求3所述的可裂解连接单元的合成方法,其特征在于,当η= 1时,步骤 e中加入的所述T-4、三乙胺和甲磺酰氯的摩尔比为1 :3 5 :1. 3 1. 5。
9.根据权利要求3所述的可裂解连接单元的合成方法,其特征在于,当η= 1时,步骤 f中加入的所述T-5、原料A和对甲苯磺酸吡啶盐的摩尔比为1 :1. 5 2 :0. 2 0. 5。
10.根据权利要求3所述的可裂解连接单元的合成方法,其特征在于,当η= 1时,步骤 g中所述的四丁基氟化胺为含lmol/L四丁基氟化胺的四氢呋喃溶液,加入的所述T-6和四丁基氟化胺的摩尔比为1 :1. 5 2。
11.根据权利要求3所述的可裂解连接单元的合成方法,其特征在于,当η= 2时,步骤 a中加入的所述2-羟基_3,4-二氢吡喃、氢化钠、和氯化苄的摩尔比为1 :3 5 :1. 5 2。
12.根据权利要求3所述的可裂解连接单元的合成方法,其特征在于,当η= 2时,步骤 b中加入的所述X-1、原料A和甲苯磺酸吡啶盐的摩尔比为1. 5 2 :1 :0. 2 0. 5。
13.根据权利要求3所述的可裂解连接单元的合成方法,其特征在于,当η= 2时,步骤 c中加入的所述Χ-2和Pd/C的质量比为1 10% 20%。
全文摘要
本发明公开了一种可裂解连接单元及其合成方法与用途。可裂解连接单元的结构式为,其中,n为1或2,m为0~20中的任意一个整数,k为1~20中的任意一个整数。该可裂解连接单元可用于DNA合成测序。与现有技术相比,本发明的化合物合成原料简单易得,合成过程均为常规化学反应,易于实现大量合成;该类化合物可与核苷酸和荧光素实现高效率的连接;通过研究该类化合物的裂解性能,发现该类化合物在温和的条件下可以实现高效率的完全裂解,可应用于DNA测序。
文档编号C08G65/00GK102516208SQ201110331659
公开日2012年6月27日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者伍新燕, 沈玉梅, 盛司潼, 邵志峰, 郭勋祥, 黎庆, 龚兵 申请人:上海交通大学, 华东理工大学, 深圳华因康基因科技有限公司

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